二硫键还原一直是抗体制造中的一个具有挑战性的问题，因为它会导致产品纯度降低，产品不合格，更重要的是，影响药物的安全性和有效性。科学家们一直在研究造成二硫键还原的根本原因，并制定解决方案来应对这一挑战。近年来，随着双特异性和三特异性抗体等更复杂分子的出现，链间二硫键不完全形成而导致的分子异质性成为迫切需要解决的问题。

鉴于生物制药行业所面临的二硫键还原挑战，在这篇综述中，作者提出了全面而科学的见解，以深入分析在抗体工艺过程中二硫还原的根本原因。

本文主要讨论三个问题：①引起二硫键还原的根本原因。②下游工艺中二硫键还原：二硫键还原对产品稳定性和工艺性能、检测和表征的分析方法、过程控制策略及其制造实施的影响。③应对二硫键还原的策略，包括平台校准、双特异性和三特异性抗体的缓解策略和应用，以及利用机器学习识别影响二硫键还原敏感分子位点。

《生物制药工艺开发——抗体二硫键还原和恢复（上）》可点击此处阅读。

二硫键还原监测和分析方法

参数研究范围的确定

如第3节所述，基于下游处理单元操作图谱识别潜在的二硫还原可能具有挑战性，因为高度还原的mAb样本和完整的mAb样本显示出相似的峰轮廓。此外，由于肽键的断裂，蛋白质的性质也会发生巨大的变化。因此，可靠的分析方法对于检测和定量蛋白质修饰是至关重要的。根据分离的机理，这些方法可分为2类：基于粒径的分离，或者氨基酸侧链化学性质进行分离。基于粒径的分离方法包括粒径排除色谱(SEC)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-page)和毛细管SDS电泳(CE-SDS)。其他分离方法通常包括基于这些物质的电荷和疏水性差异的各种类型的色谱。除了上述在工艺开发和质量释放测试过程中监测和定量蛋白质片段的方法外，还可以使用质谱(MS)完成准确的裂解位点的鉴定和对这些片段的进一步表征。

由于物理尺寸的差异，基于尺寸的分离方法通常是简单的，而其他化学降解的氨基酸侧链不容易检测。只有在两个片段分离后，才能检测到肽键的断裂。另外，这些二硫还原物之间的非共价相互作用（例如疏水相互作用）可能会阻止天然条件下两个片段的分离。因此，可能需要变性以检测折叠的免疫球蛋白结构域中的裂解。相反，在天然条件下，SEC可容易地检测到铰链区中的裂解。SEC和未还原的CE-SDS结果（部分还原的样品）表明，尽管大多数链间二硫键均被破坏，但其天然结构是完整的（图S3）。

近年来，CE-SDS方法已成为常规SDS-PAGE方法的有价值的替代方法，用于抗体的表征和自动定量。通过提供出色的碎片分离度，CE-SDS方法已在生物技术行业中广泛用于监测工艺开发过程中的总体碎片化，由于荧光定量的直接定量和更高的灵敏度如今已广泛用于最终原料药和药品GMP放行以及过程中测试。此外，近年来，基于芯片的蛋白质表征系统已被用于传统平板凝胶电泳的自动化替代方法，同时还提供了生物治疗学和基因组学工作所需的高通量和数据质量。

SEC通常被认为是对聚集体进行定量的金标准方法，但是由于片段可能与单体峰共洗脱并导致较差的分离度，因此SEC很少用于定量片段化。因此，SEC可以在变性条件（dSEC）下运行，例如在流动相中或样品制备过程中在盐酸胍，SDS或有机溶剂的存在下运行。变性SEC是定量确定蛋白质片段的另一种分离方法。与基于SDS的方法相似，使用变性试剂（例如6M胍）在50°C下变性蛋白质60分钟，然后将其注入含有胍的流动相的SEC柱中。在SEC色谱柱上进行分离之前，变性试剂将使片段脱离缔合。变性SEC的分离分辨率可能不如基于SDS的方法。但是，由于其相对较高的上样量，变性SEC可以成为分离和剔除分离片段以进行进一步表征的有用工具。变性SEC与MS结合使用是表征蛋白质片段的非常强大的工具。变性SEC-MS可以作为在线方法进行操作，该方法在SEC流动相中使用有机溶剂，然后进行MS检测。有机溶剂用作变性剂，可在SEC分离之前将IgG轻链与重链分离，从而使质谱仪能够测量解离的IgG重链和轻链。例如，改进的SE-UPLC与MS联用，采用包含乙腈（ACN），三氟乙酸（TFA）和甲酸的流动相，可以分离抗体轻链和重链，并获得直接的分子量测量结果。

近年来，过程分析技术（PAT）取得了显着进步，该技术使实时监视和控制能够通过更好地理解过程来保持一致的产品质量。在过程的关键单元操作中对生物过程进行实时监控和分析的集成是实现生物药物实时释放的最重要的条件之一。例如，可以在下游操作期间使用各种PAT工具监视蛋白质纯度（一种关键的质量属性（CQA））。另一个示例是，使用变性SEC的PAT应用程序可以与ProteinA色谱法集成在一起，以提供产品纯度的实时数据，并执行必要的过程控制策略以确保产品质量。

降低二硫键还原以及恢复已还原mAb的方法

概述

如前所述，单抗生产过程中存在二硫键还原，影响单抗稳定性，因此将二硫键还原最小化对于确保高工艺收率和最终原药纯度至关重要。由于酶催化氧化还原反应是二硫键还原的根本原因，在生产过程中采用了直接或间接抑制或减缓氧化还原反应的方法来消除二硫键还原。通常，这些预防方法应用于上游的生产步骤，如细胞培养、细胞培养液收集和存储(图5，表1)。然而，防止二硫键还原的方法也存在一定的局限性，如延长操作时间、增加设备成本和降低操作灵活性。为了保证生产过程的灵活性和效率，用以恢复还原的单克隆抗体和处理有问题批次的方法值得考虑，以解决二硫键还原的挑战。在生产过程中，可以将氧化还原体系引入色谱步骤，以恢复先前还原的单克隆抗体(图5，表1)。恢复后的单克隆抗体表现出与完整单克隆抗体相同的特性，且对最终药品质量没有负面影响。

构建二硫键还原的缩小模型

据报道，二硫键还原主要是在大规模生产过程中观察到的，而实验室小规模很少观察到。此外，在生产过程中，二硫键的还原水平可能会有显著的变化。因此，对于实验室规模的研究而言，开发可靠的按比例缩小模型以证明二硫键还原至关重要。一种通用方法是创建最坏情况的二硫键还原样品，其中HCCF被完全均质化以释放引起二硫键还原的细胞内酶。然后可以将裂解的HCCF与未裂解的HCCF以不同的比例混合，以产生具有不同二硫键还原水平的样品。此外，为防止游离的硫醇再氧化，将澄清的物料（CB）用N2气体吹扫并在室温下于厌氧环境中储存。

防止二硫键还原的方法

如图5所示，在不同的生产阶段，可以采用多种方法来防止(或消除)二硫键还原。根据它们对酶催化氧化还原反应的影响，我们将这些方法分为四类：

抑制细胞内酶过表达

Trx是负责二硫键还原的末端酶。如果细胞不能过表达Trx，则酶系统的活性将被显着抑制。Koterba等证明了通过使用Trx敲除CHO细胞减少的二硫键还原。他们的研究表明，抑制Trx过表达不会影响整体细胞的生长。通过将细胞裂解液与完整IgG孵育24小时，工程细胞裂解液（Trx低表达）中仍保留有高于50%的完整IgG，而在对照细胞裂解液（Trx过表达）中，完整IgG接近于0%。该结果表明可以抑制细胞中的Trx过表达并使由细胞裂解引起的二硫键还原最小化。但是，这种控制二硫键还原的方法取决于其他酶的浓度：如果其他酶的浓度较高，则氧化还原反应仍可被有效催化并导致高水平的二硫键还原。

抑制酶活性

金属离子和螯合可以抑制酶催化氧化还原反应的不同步骤。例如，乙二胺四乙酸（EDTA）可以抑制己糖激酶活性并减少葡萄糖-6-P的形成。Cu2+，Zn2+，Hg2+和Co2+可以抑制Trx活性。硫代葡萄糖（ATG）和苹果酸（ATM）可以抑制TrxR活性。抑制剂可以在较早的生产过程中引入，例如细胞培养基或HCCF（过滤前后），抑制剂的最终浓度为微摩尔至毫摩尔水平。以前的研究表明，如果抑制剂的效率很高，它可以在HCCF储存2-3天的时间内完全抑制二硫键的还原。但是，在较长HCCF储存时间下有关抑制剂性能的研究受到了限制，可能需要进一步研究。

减少酶的量

如果较少的酶可用于催化二硫键氧化还原反应，则二硫键的还原也可以降至最小。一种方法是引入可以与酶反应的组分，作为竞争性反应途径来消耗酶，因此无法用于还原二硫键。如根本原因分析部分所述，O2可以与NADPH反应。因此，提高HCCF中的DO含量可以最大程度地减少二硫键的还原。例如，研究人员发现通过空气喷射将DO含量保持在最低30%可以防止二硫键还原，并保持90%以上的完整mAb。除O2外，最佳浓度的H2O2和L-胱氨酸还可以与酶反应，并减少可用于还原二硫键的酶。因此，研究人员在HCCF中引入微摩尔水平的H2O2和L-胱氨酸，以消除二硫键的还原。另一种方法是在CCF收获步骤中最大程度地减少细胞裂解，因此，分泌到CCF中的酶会更少。这可以通过在收获步骤中最小化细胞剪切力来实现，例如使用密封式离心机，或将深度过滤压差控制为低于某些值。

降低酶促反应速率，缩短反应时间

降低HCCF的pH值和温度或缩短HCCF的保存时间均可减缓酶促反应。这些方法可以与其他方法相结合，以进一步消除二硫键还原。需要注意的是，降低pH值并不常用，因为它会改变单抗周围的微环境，并可能导致单抗聚集。

尽管有不同的方法可以最大程度地减少生产过程中的二硫键还原，但这些方法也有一些局限性：（1）从基因上抑制酶在细胞中的过表达可能会延长mAb的开发时间，这也可能增加未正确表达mAb的风险，因为转基因的突变体克隆可能在第一阶段的抗体选择过程中无法生存；（2）消除二硫键还原的抑制剂的类型和浓度可能因每种mAb而异，因此优化抑制剂的选择可能会很费时；（3）需要对原料药中最终抑制剂的浓度进行监测和控制，并且可能需要额外的制造步骤以去除抑制剂，以达到原料药GMP放行要求。（4）通空气、降低储存温度和减少储存时间可能需要设备的额外财政投资，从而增加了制造过程的成本并降低了制造过程的灵活性。因此，在生产过程中应考虑开发恢复（或“挽回”）还原的二硫键的工艺。

在下游处理过程中挽回还原的mAb

由于控制二硫键还原的操作灵活性和效率的限制，挽回和恢复已经还原的单抗成为一种引人注目的替代方法。与消除法相比，恢复法具有以下优点:(1)挽回还原的单克隆抗体。(2)进一步降低下游工艺步骤中单抗二硫键还原的风险。(3)由于该方法不需要额外的设备，也不需要额外的操作步骤，因此更加灵活和经济有利。

还原的mAb恢复涉及还原的mAb与氧化还原试剂之间的巯基-二硫键交换反应。硫醇-二硫化物交换反应包括两个步骤（图S4）。第一步，通过游离巯基去质子化反应形成的亲核硫醇盐基团（S-）攻击氧化还原试剂的一个硫原子，并且在氧化还原试剂和mAb之间形成二硫键（图S4A）；在第二步中，mAb中的剩余硫醇基团攻击新形成的二硫键，释放出氧化还原试剂并在mAb中形成二硫键（图S4B）。尽管已经广泛研究了硫醇-二硫键交换反应，以提供对细胞中二硫键形成关系的更深入了解，但很少有文献将这种反应用于在生产过程中恢复还原的mAb。在我们最近的内部研究中，我们通过在蛋白A色谱步骤中使用氧化还原试剂缓冲液半胱氨酸/胱氨酸作为洗涤缓冲液成功回收了还原的mAb（图S5，数据未显示）。根据本研究开发的动力学模型，对半胱氨酸/胱氨酸浓度，pH和mAb/氧化还原缓冲液的接触时间进行了优化，以回收被二硫键还原的mAb。结果表明，mAb的纯度从上样的5%提高到洗脱的90%。发现胱氨酸浓度和pH是影响还原mAb恢复率的最关键因素。为了获得较高的mAb恢复率，建议将缓冲液的pH设置为8至10，并建议最少60分钟的mAb/氧化还原缓冲液接触时间。基于各种生化和生物物理分析特性，恢复后的mAb表现出与原始完整mAb相当的性能。研究表明，在下游过程中应用恢复法来生产可接受的高质量mAb产品用于潜在临床用途的可行性。

生产过程中二硫键还原的预测和监测

除了消除二硫键还原的方法和恢复已被还原的mAb方法外，在生产过程中积极应用过程分析技术（PAT）进行二硫键还原的预测和在线/实时监测也很重要。PAT可以在早期工艺步骤中检测到二硫键还原的情况，因此可以进行适当的监控，并及时应用预防方法或恢复方法以确保最终产品的质量。此外，二硫键还原的实时分析结果可以提供对生产过程中二硫键还原的根本原因的定量了解，并可以进行更有效的控制以改善工艺设计。此外，二硫键还原的实时分析结果可以提供对生产过程中二硫键还原的根本原因的定量了解，并可以进行更有效的控制以改善工艺设计。

还据报道，细胞培养物氧化还原电势与抗体还原之间的相关性可用于预测早期生产工艺步骤中的硫键还原水平。通过在线细胞培养物氧化还原电位测量并分析了细胞培养后期（如第12天和第14天）完整mAb的量，发现-70mV的氧化还原电位可用作IgG2的细胞培养物氧化还原电位阈值。高于该氧化还原电势，则二硫键还原的水平最小，而低于该氧化还原电势，二硫键的还原水平可能有很大的不同。这些研究人员还设计了一种氧化还原还原控制系统，通过添加CuSO4和/或提高溶解氧水平来维持细胞培养物的氧化还原电位高于阈值，并成功将细胞培养物中二硫键还原水平保持在最低水平。

除了在细胞培养步骤中使用氧化还原电位作为预测工具外，还可以控制HCCF中的游离硫醇水平以预测二硫键的还原水平，并可以采取适当的措施来降低风险。在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系的典型单克隆抗体生产过程中，我们基于二硫化物还原风险确定了HCCF中游离硫醇的三个关键阈值：μM（低风险）；-μM（中等风险）和μM（高风险）。对于高风险HCCF，除了低温保存和维持通气外，还应尽早通过ProteinA色谱法对收获的材料进行处理。为了进一步降低二硫键还原的风险，如果执行多个ProteinA运行周期，则将每个洗脱池分开保存。

对于诸如ProteinA色谱法和离子交换色谱法之类的下游工艺步骤，目前尚无关于将在线分析方法用于二硫键还原的研究报道。但是，成功整合在线液相色谱（LC）进行电荷变异和尺寸变异分析，显示了在线二硫键还原监测和分析的潜力。

Alvarez等人设计了一种内部在线液相色谱（LC）-质谱（MS）系统，该系统可以直接将感兴趣的部分从离子交换色谱（IEC）和尺寸排阻色谱（SEC）捕获到反相（RP）捕集盒进行脱盐，然后在MS中分析样品。他们成功鉴定出由于该系统糖基化水平不同而产生的mAb电荷变异体。近年来，已经开发了商业在线过程分析系统。Patel及其同事使用商业PATROL?UPLC过程分析系统开发了一种在线离子交换液相色谱仪，该系统基于近实时电荷变化分析指导下游操作期间的样品合并。Patel研究中使用的商业PATROLUPLC过程分析系统也可以用于开发在线SEC检测。在我们最近的内部研究中，在线SEC设置显示了能够在天然条件和变性条件下研究IEC组分大小变异成分（LMW，单体和HMW）的能力，并且未来可能被开发用于二硫键还原mAb的鉴定。

还原二硫化物的消除和还原单克隆抗体恢复方法的案例研究

此案例研究说明了在生产过程中同时使用预防策略和恢复策略来控制二硫键还原的示例，如第6节中详细介绍和图5所示。总而言之，预防策略本质上应用了温度控制以及氧气控制以防止二硫键还原，并且恢复法表明，原本“浪费”的二硫键还原的抗体仍可以通过在ProteinA色谱中重新氧化还原的二硫键来挽救和恢复。

图6A说明了一项全面的研究计划，其中使用了三种mAb（mAb-1，mAb-2和mAb3）的HCCF进行研究。每个HCCF分为两个池，分别经过两个处理和存储条件：“goodHCCF”（空气喷射+4°C）和“badHCCF”（氮喷射+室温（19?25°C））。两种HCCF分别通过使用两种Wash2缓冲液（对照缓冲液和Redox缓冲液）的ProteinA纯化进行处理。图6B和6C比较了使用两个ProteinA清洗臂对完整和还原形式的三个mAb进行纯化的产物纯度和聚集情况。观察到，使用两个洗涤臂，所有三个mAb的“goodHCCF”均保持了较高的产品纯度，这表明预防策略（收获液冷藏储存+溶氧）能够防止蛋白质A步骤之前二硫键的还原。相反，使用对照洗脱条件（arm1：高pH，无氧化还原洗脱）的“badHCCF”，所有三种mAb的纯度均较低（50%）。但是，通过使用氧化还原洗脱液（arm2）获得了较高的产品纯度，这证明了氧化还原洗脱液可增强ProteinA色谱柱上的二硫键重整作用。

实施预防策略或恢复策略或两者同时使用，可以解决二硫化物还原问题，以实现高纯度抗体产品。此外，该案例研究表明，氧化还原洗脱液对工艺产量或产品质量没有负面影响。对恢复后的抗体表征，证实了链间二硫键的完全形成，且生物物理特性与对照相当。

结论和展望

二硫键还原是生物制品生产过程中经常遇到的技术难题，对其进行有效的管理将有助于满足蛋白质质量规范和治疗效率的关键要求，因此在生物技术领域受到越来越多的

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